Microbe-mediated recovery of salt marshes contaminated with oil hydrocarbons

Salt marshes are highly productive intertidal habitats that serve as nursery grounds for many commercially and economically important species. Because of their location and physical and biological characteristics, salt marshes are considered to be particularly vulnerable to anthropogenic inputs of oil hydrocarbons. Sediment contamination with oil is especially dangerous for salt marsh vegetation, since low molecular weight aromatic hydrocarbons can affect plants at all stages of development. However, the use of vegetation for bioremediation (phytoremediation), by removal or sequestration of contaminants, has been intensively studied. Phytoremediation is an efficient, inexpensive and environmental friendly approach for the removal of aromatic hydrocarbons, through direct incorporation by the plant and by the intervention of degrading microbial populations in the rhizosphere (microbe-assisted phytoremediation). Rhizosphere microbial communities are enriched in important catabolic genotypes for degradation of oil hydrocarbons (OH) which may have a potential for detoxification of the sediment surrounding the roots. In addition, since rhizosphere bacterial populations may also internalize into plant tissues (endophytes), rhizocompetent AH degrading populations may be important for in planta AH degradation and detoxification. The present study involved field work and microcosms experiments aiming the characterization of relevant plant-microbe interactions in oilimpacted salt marshes and the understanding of the effect of rhizosphere and endosphere bacteria in the role of salt marsh plants as potential phytoremediation agents. In the field approach, molecular tools were used to assess how plant species- and OH pollution affect sediment bacterial composition [bulk sediment and sediment surrounding the roots (rhizosphere) of Halimione portulacoides and Sarcocornia perennis subsp. perennis] in a temperate estuary (Ria de Aveiro, Portugal) chronically exposed to OH pollution. In addition, the 16S rRNA gene sequences retrieved in this study were used to generate in silico metagenomes and to evaluate the distribution of potential bacterial traits in different microhabitats. Moreover, a combination of culture-dependent and -independent approaches was used to investigate the effect of oil hydrocarbons contamination on the structure and function of endophytic bacterial communities of salt marsh plants.Root systems of H. portulacoides and S. perennis subsp. perennis appear to be able to exert a strong influence on bacterial composition and in silico metagenome analysis showed enrichment of genes involved in the process of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) degradation in the rhizosphere of halophyte plants. The culturable fraction of endophytic degraders was essentially closely related to known OH-degrading Pseudomonas species and endophytic communities revealed sitespecific effects related to the level of OH contamination in the sediment. In order to determine the effects of oil contamination on plant condition and on the responses in terms of structure and function of the bacterial community associated with plant roots (rhizosphere, endosphere), a microcosms approach was set up. The salt marsh plant Halimione portulacoides was inoculated with a previous isolated Pseudomonas sp. endophytic degrader and the 2-methylnaphthalene was used as model PAH contaminant. The results showed that H. portulacoides health and growth were not affected by the contamination with the tested concentration. Moreover, the decrease of 2-methylnaphthalene at the end of experiment, can suggest that H. portulacoides can be considered as a potential plant for future uses in phytoremedition approaches of contaminated salt marsh. The acceleration of hydrocarbon degradation by inoculation of the plants with the hydrocarbon-degrading Pseudomonas sp. could not, however, be demonstrated, although the effects of inoculation on the structure of the endophytic community observed at the end of the experiment indicate that the strain may be an efficient colonizer of H. portulacoides roots. The results obtained in this work suggest that H. portulacoides tolerates moderate concentrations of 2-methylnaphthalene and can be regarded as a promising agent for phytoremedition approaches in salt marshes contaminated with oil hydrocarbons. Plant/microbe interactions may have an important role in the degradation process, as plants support a diverse endophytic bacterial community, enriched in genetic factors (genes and plasmids) for hydrocarbon degradation.

Matéria húmica de sapal: variações estruturais e complexação com o cobre

No presente trabalho foram estudadas as variações na composição, estrutura e comportamento das substâncias húmicas sedimentares (SHS), promovidas pela presença de duas espécies de plantas da família Chenopodiacea, presentes nos sapais da Ria de Aveiro: a Halimione portulacoides e a Arthrocnemum fruticosum. Para além das variações espaciais horizontais, foram investigadas as variações ao longo de um perfil de profundidades. Desta forma, para além da camada superficial (0-10 cm) de sedimentos com diferentes espécies de plantas e sem plantas, também foram investigadas camadas de sedimentos intermédia (20-25 cm) e profunda (45-50 cm). Para a extracção das SHS recorreu-se a uma pequena modificação do método proposto pela International Humic Substances Society (IHSS) para extracção e purificação de substâncias húmicas de solos. As SH extraídas foram caracterizadas através dos métodos espectroscópicos de absorção no ultravioleta visível, de fluorescência molecular síncrona, de absorção no infravermelho com transformadas de Fourier (FTIR) e de RMN 13C em estado sólido. Estas técnicas de caracterização foram complementadas pela análise elementar e termogravimetria. Em algumas amostras, foram ainda determinados o conteúdo em alguns metais por ICP-AES e o conteúdo funcional ácido por titulações potenciométricas. Após exaustiva caracterização das amostras de AH, procedeu-se ao estudo da sua capacidade de complexação com o cobre, recorrendo a titulações monitorizadas por fluorescência molecular síncrona. Os resultados revelaram que a colonização de sedimentos por plantas vasculares superiores conduz a uma alteração profunda no ambiente sedimentar e que esta é reflectida na diagénese das substâncias húmicas sedimentares, tendo-se observado variações a uma pequena escala espacial. O estudo deste tipo de variações nunca tinha sido efectuado em trabalhos anteriores. Nos ácidos fúlvicos detectaram-se diferenças na composição e estrutura das amostras correspondentes às camadas superiores de sedimentos, reflectindo a presença de diferentes colonizações vegetais. Relativamente aos ácidos húmicos, foi possível classificá-los em dois tipos distintos. Os AH do tipo I correspondem aos sedimentos superficiais e intermédios dos locais com plantas. Neste tipo de AH verificou-se uma incorporação de polissacarídeos e estruturas peptídicas, em estados de humificação pouco desenvolvidos. Os AH do tipo II correspondem aos sedimentos mais profundos de todos os locais e aos intermédios do local sem plantas e caracterizam-se por um maior grau de humificação e polimerização, um maior conteúdo aromático e de estruturas conjugadas e um maior conteúdo de grupos carboxílicos. Essas diferenças estruturais conduzem a diferentes comportamentos ácido/base e de complexação com o cobre. Assim, os AH do tipo I, que apresentam sinais espectroscópicos mais baixos associados a grupos carboxílicos e fenólicos, têm menor conteúdo de grupos funcionais ácidos e menor capacidade de complexação com o cobre quando se consideram ligandos característicos de unidades aromáticas conjugadas. Relativamente aos valores de log K dos complexos de AHS com o cobre, as amostras representativas da camada superficial dos sedimentos com plantas apresentaram valores superiores aos das restantes amostras de AH estudadas, cujos valores de log K são similares entre si. Atendendo aos resultados de análise elementar e espectroscópica, este facto pode estar associado à presença de compostos de azoto não peptídicos. Quanto a outros ligandos para o cobre, nomeadamente os representativos de estruturas peptídicas contendo o aminoácido triptofano e estruturas aromáticas simples, não foi possível obter resultados conclusivos. Dado que os ácidos húmicos do tipo I demonstraram um maior conteúdo peptídico e menor conteúdo aromático, o estudo destes ligandos torna-se importante para compreender melhor o efeito da presença de plantas nos sedimentos de sapal sobre o comportamento dos ácidos húmicos sedimentares como ligandos para o cobre. Refere-se ainda que foram detectadas certas especificidades na variação das características do sedimento e das substâncias húmicas com a profundidade nos diferentes locais estudados que não podem ser explicadas meramente com a presença de material vegetal oriundo de diferentes espécies de plantas, requerendo um conhecimento mais aprofundado das comunidades bentónicas e do ambiente físico-químico do sedimento.

Serviços dos ecossistemas prestados pelos estuários : especiação e capacidade de retenção do fósforo

O fator nutricional presente nos sapais não é só importante para os organismos que nele habitam como também apresenta uma importância ecológica a uma maior escala. Exemplifica-se este fato com a capacidade de retenção do Fósforo (P) por parte das plantas podendo estas competir como produto químicos para sua imobilização através da incorporação da sua fração biodisponível para cumprimento dos mecanismos básicos de sobrevivência. O rizosedimento dessas plantas é uma importante fonte de nutrientes necessários para garantia básica da perpetuação de todos os serviços (regulação, provisão, cultural) gerados pelo ambiente. A perda de áreas de sapal foi o motivo principal para a elaboração desta tese visto a preocupação em relação aos impactes que a perda de serviços associados à área de estudo escolhida, o sistema lagunar da Ria de Aveiro, poderá vir sofrer caso aconteçam alterações hídricas (naturais ou antrópicas) mais acentuadas no futuro. Essa tese assume como compromisso chamar a atenção para essa questão como também investigar os mecanismos do ciclo do P este importante nutriente considerado essencial para a manutenção da vida em nosso planeta. Para este estudo foram escolhidas 3 espécies de plantas halófitas representantes do sapal amostral, são elas: Bolbochenous maritimus, Spartina maritima e de Juncus maritimus. As questões levantadas buscam compreender o papel do P nas transformações que ocorrem no rizosedimento das halófitas em 3 diferentes contextos: (i) quando comparados os valores da biomassa de P associado às halófitas estudadas (estudo realizado nos sapais povoados por Spartina maritima e Juncus maritimus) em toda extensão da Ria de Aveiro (ii) quando da disponibilidade de P perante a presença de poluentes inorgânicos no Largo do Laranjo, que corresponde a uma zona historicamente contaminada por metais (estudo realizado no rizosedimento das espécies Bolbochenous maritimus e Juncus maritimus) e (iii) quanto à intrusão superficial da água salgada da laguna (estudo focado na avaliação da perda do P próximo às raízes das halófitas que habitam a zona externa do dique do Baixo Vouga Lagunar (BVL) que corresponde à zona de confluência do Rio Vouga com a Ria de Aveiro). Por meio da análise do rizosedimento e da biomassa das diferentes halófitas predominantes do sapal foi possível verificar que, em relação à carga nutritiva fosfática, de Norte (Canal de São Jacinto/Ovar) a Sul (Canal de Mira) da Ria de Aveiro, a cota do sapal é mais importante do que a natureza espacial do sistema. Esta informação é primordial para a assertividade de futuras medidas de criação e reabilitação das áreas de sapal na Ria de Aveiro. Os estudos realizados nas áreas impactadas (Largo do Laranjo e BVL) incidiram na análise do perfil vertical rizosedimentar das halófitas pertencentes ao sapal médio-alto. Estes estudos revelaram que o rizosedimento dessas halófitas possui características peculiares que definem a dinâmica do ciclo do P de forma bastante característica. O rizosedimento das halófitas presentes no Largo do Laranjo apresentaram teores biodisponíveis de P equivalentes àqueles presentes no rizosedimento de área mais afastada da fonte pontual de contaminação para as mesmas espécies. Numa visão otimista, os resultados revelam que ambos sapais, Largo de Laranjo e Cais do Bico, apresentam condições equiparável para perpetuação dos serviços por eles gerados, que nesse caso se tornam ainda mais valiosos devido a garantia da fitoestabilização dos contaminantes (prevenção da entrada de contaminantes na coluna d’água e na cadeia alimentar). No Baixo Vouga Lagunar a análise espacial do sapal na zona exterior ao dique revelou a perda da diversidade das espécies bem como o aumento da área de vasa e consequentemente a perda dos teores de P associados ao rizosedimento das halófitas mais expostas aos efeitos da compressão costeira intensificados pelas ações naturais e antrópicas a que a Ria está sujeita. Em geral, a degradação dessa área de sapal devido aos fenômenos de assoreamento ou de erosão não pode ser separada dos processos sedimentares na área envolvente, principalmente no caso da Ria de Aveiro que tem sofrido constantes mudanças para atender às necessidades das atividades humanas. Essa tendência provavelmente não mudará no futuro próximo. Consequentemente, a evolução da laguna será principalmente dependente do resultado direto das ações humanas que deverão sempre encontrar formas de compensar os danos causados no âmbito de intervenções de reabilitação do sistema hídrico. A recriação de áreas de sapal pode ter lugar como medida mitigadora no âmbito de intervenções de reabilitação de áreas degradadas e ainda poderá servir como forma de captura de P para programas de utilização de fertilizantes naturais (componente desejável para a agricultura moderna o que é particularmente importante para as regiões altamente dependentes do mercado de importação). Deste modo, recomenda-se que a recuperação das áreas de sapal seja enquadrada no âmbito de intervenções mais amplas de valorização dos sistemas estuarinos e lagunares.

Calibration and validation of hydrodynamic, salt and heat transport models for Ria de Aveiro lagoon (Portugal)

Ria deAveiro is a very complex shallow water coastal lagoon located on the northwest of Portugal. Important issues would be left unanswered without a good understanding of hydrodynamic and transport processes occurring in the lagoon. Calibration and validation of hydrodynamic, salt and heat transport models for Ria de Aveiro lagoon are presented. The calibration of the hydrodynamic model was performed adjusting the bottom friction coefficient, through the comparison between measured and predicted time series of sea surface elevation for 22 stations. Harmonic analysis was performed in order to evaluate the model's accuracy. To validate the hydrodynamic model measured and predicted SSE values were compared for 11 stations, as well as main flow direction velocities for 10 stations. The salt and heat transport models were calibrated comparing measured and predicted time series of salinity and water temperature for 7 stations, and the RMS of the difference between the series was determined. These models were validated comparing the model results with an independent field data set. The hydrodynamic and the salt and heat transport models for Ria de Aveiro were successfully calibrated and validated. They reproduce accurately the barotropic flows and can therefore adequately represent the salt and heat transport and the heat transfer processes occurring in Ria deAveiro.

Analysis of the organic matter associated to sea salt : definition of potential molecular markers based on the volatile composition and presence of glycosidic derivatives and polysaccharides

Sea salt is a natural product obtained from the evaporation of seawater in saltpans due to the combined effect of wind and sunlight. Nowadays, there is a growing interest for protection and re-valorisation of saltpans intrinsically associated to the quality of sea salt that can be evaluated by its physico-chemical properties. These man-made systems can be located in different geographical areas presenting different environmental surroundings. During the crystallization process, organic compounds coming from these surroundings can be incorporated into sea salt crystals, influencing their final composition. The organic matter associated to sea salt arises from three main sources: algae, surrounding bacterial community, and anthropogenic activity. Based on the hypothesis that sea salt contains associated organic compounds that can be used as markers of the product, including saltpans surrounding environment, the aim of this PhD thesis was to identify these compounds. With this purpose, this work comprised: 1) a deep characterisation of the volatile composition of sea salt by headspace solid phase microextraction combined with comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry (HS-SPME/GCGC–ToFMS) methodology, in search of potential sea salt volatile markers; 2) the development of a methodology to isolate the polymeric material potentially present in sea salt, in amounts that allow its characterisation in terms of polysaccharides and protein; and 3) to explore the possible presence of triacylglycerides. The high chromatographic resolution and sensitivity of GC×GC–ToFMS enabled the separation and identification of a higher number of volatile compounds from sea salt, about three folds, compared to unidimentional chromatography (GC–qMS). The chromatographic contour plots obtained revealed the complexity of marine salt volatile composition and confirmed the relevance of GC×GC–ToFMS for this type of analysis. The structured bidimentional chromatographic profile arising from 1D volatility and 2D polarity was demonstrated, allowing more reliable identifications. Results obtained for analysis of salt from two locations in Aveiro and harvested over three years suggest the loss of volatile compounds along the time of storage of the salt. From Atlantic Ocean salts of seven different geographical origins, all produced in 2007, it was possible to identify a sub-set of ten compounds present in all salts, namely 6-methyl-5-hepten-2-one, 2,2,6-trimethylcyclohexanone, isophorone, ketoisophorone, β-ionone-5,6-epoxide, dihydroactinidiolide, 6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone, 3-hydroxy-2,4,4-trimethylpentyl 2-methylpropanoate, 2,4,4-trimethylpentane-1,3-diyl bis(2-methylpropanoate), and 2-ethyl-1-hexanol. These ten compounds were considered potential volatile markers of sea salt. Seven of these compounds are carotenoid-derived compounds, and the other three may result from the integration of compounds from anthropogenic activity as metabolites of marine organisms. The present PhD work also allowed the isolation and characterisation, for the first time, of polymeric material from sea salt, using 16 Atlantic Ocean salts. A dialysis-based methodology was developed to isolate the polymeric material from sea salt in amounts that allowed its characterisation. The median content of polymeric material isolated from the 16 salts was 144 mg per kg of salt, e.g. 0.014% (w/w). Mid-infrared spectroscopy and thermogravimetry revealed the main occurrence of sulfated polysaccharides, as well as the presence of protein in the polymeric material from sea salt. Sea salt polysaccharides were found to be rich in uronic acid residues (21 mol%), glucose (18), galactose (16), and fucose (13). Sulfate content represented a median of 45 mol%, being the median content of sulfated polysaccharides 461 mg/g of polymeric material, which accounted for 66 mg/kg of dry salt. Glycosidic linkage composition indicates that the main sugar residues that could carry one or more sulfate groups were identified as fucose and galactose. This fact allowed to infer that the polysaccharides from sea salt arise mainly from algae, due to their abundance and composition. The amino acid profile of the polymeric material from the 16 Atlantic Ocean salts showed as main residues, as medians, alanine (25 mol%), leucine (14), and valine (14), which are hydrophobic, being the median protein content 35 mg/g, i.e. 4,9 mg per kg of dry salt. Beside the occurrence of hydrophobic volatile compounds in sea salt, hydrophobic non-volatile compounds were also detected. Triacylglycerides were obtained from sea salt by soxhlet extraction with n-hexane. Fatty acid composition revealed palmitic acid as the major residue (43 mol%), followed by stearic (13), linolenic (13), oleic (12), and linoleic (9). Sea salt triacylglycerides median content was 1.5 mg per kg of dry salt. Both protein and triacylglycerides seem to arise from macro and microalgae, phytoplankton and cyanobacteria, due to their abundance and composition. Despite the variability resulting from saltpans surrounding environment, this PhD thesis allowed the identification of a sea salt characteristic organic compounds profile based on volatile compounds, polysaccharides, protein, and triacylglycerides.